Princípy syntézy nukleových kyselín

Syntéza nukleových kyselín sa uskutočňuje metódou sialového amidu triglyceridu na pevnej fáze, pričom 3' koniec DNA je imobilizovaný na substráte pevnej fázy a nukleotidy sa pridávajú v smere 3' až 5', kým sa nesyntetizuje požadovaný fragment DNA. .To sa líši od syntézy DNA aplikáciou DNA polymerázy.

3′ koniec prvej bázy je imobilizovaný na CPG počas syntézy, 5′-OH ďalšej bázy je chránený di-p-tolyltrityl DMT, aminoskupina na báze je chránená kyselinou benzoovou a 3′ -OH sa potom aktivuje aminofosfátovou zlúčeninou.1 báza z 5 5′-OH z 1 bázy a 3′-OH z ďalšej bázy tvorí fosfittriglycerid, ktorý sa potom oxiduje jódom na fosforečnan triglycerid, ochranná látka na druhej báze 5′-OH sa odstráni pomocou pridanie kyseliny dichlóroctovej DM cykluje pridaním ďalšej bázy a po syntéze sa ochranný prostriedok na 5'-OH odstráni slabou kyselinou Fragment sa odpojí od pevnej živice koncentrovaným hydroxidom amónnym, ochranný prostriedok sa odstráni z bázy s koncentrovaným hydroxidom amónnym pri zahrievaní, hydroxid amónny sa odstráni, fragment sa suší vo vákuu a nukleová kyselina sa čistí kvapalinovou chromatografiou alebo PAGE.

Kroky syntézy oligo

Deblokovanie

The5 koncová DMT ochranná skupina sa odstráni pridaním roztoku TCA.

Aktivácia

Zmiešanie aktivátora s oligonukleotidovým monomérom za vzniku aktívneho oligonukleotidového monomérneho medziproduktu.

Spojka

5-koncová hydroxylová skupina reaguje s aktívnym oligonukleotidovým medziproduktom v antigeneratívnej kondenzačnej reakcii za vzniku nestabilnej fosfittriglyceridovej väzby.

Obmedzenie 

Pridanie uzatváracieho činidla vykoná acetylačnú uzatváraciu reakciu s prebytkom hydroxylových skupín, ktoré sa nezúčastňujú kondenzačnej reakcie.

Oxidácia 

Pridanie roztoku jódu obsahujúceho vodu reaguje s nestabilnými fosfitovými väzbami oxidáciou za vzniku stabilných triglyceridových väzieb kyseliny fosforečnej.

Kyanoetylové štiepenie

Produkt nukleovej kyseliny po syntéze s pridaním roztoku DEA na odstránenie kyanoetylovej skupiny z fosfátovej triglyceridovej väzby.

Cleaved&Deprotection

Fragmenty nukleovej kyseliny sa odštiepia od tuhej fázy nosiča pridaním koncentrovaného roztoku hydroxidu amónneho a potom sa zahrejú, aby sa odstránili ochranné skupiny z vodíkových väzieb báz.